6.Catalase test:-

اختبار الكاتلاز هو اختبار مهم بشكل خاص يستخدم لتحديد ما إذا كانت المكورات موجبة الجرام هي المكورات العنقودية أو العقديات. الكاتلاز هو إنزيم يحول بيروكسيد الهيدروجين إلى ماء وغاز أكسجين. الاختبار سهل الأداء ؛ يتم خلط البكتيريا ببساطة مع H2O2. إذا ظهرت الفقاعات (بسبب إنتاج غاز الأكسجين) ، تكون البكتيريا موجبة للكتلاز. إذا لم تظهر أي فقاعات ، تكون البكتيريا سالبة الكاتلاز. المكورات العنقوديةStaphylococcus والمكورات الدقيقة النيابةMicrococcus spp. هي موجبة الكاتلاز في حين أن Streptococcus و Enterococcus spp سلبية الكاتلاز.


مبدأ اختبار كاتالاز :-

يتوسط إنزيم الكاتلاز تكسير بيروكسيد الهيدروجين إلى أكسجين وماء. يتضح وجود الإنزيم في العزلة البكتيرية عندما يتم إدخال لقاح صغير في بيروكسيد الهيدروجين ، ويحدث التطور السريع لفقاعات الأكسجين. يتضح نقص الكاتلاز من خلال نقص أو ضعف إنتاج الفقاعات. يجب ألا يزيد عمر الثقافة عن 24 ساعة.



وبالتالي تحمي البكتيريا نفسها من التأثير المميت لبيروكسيد الهيدروجين الذي يتراكم كمنتج نهائي لعملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات الهوائية.

الغرض أو استخدامات اختبار كاتالاز:-

1.يمكن التفريق بين المكورات المعوية المتشابهة شكليًا (سلبي الكاتلاز) والمكورات العنقودية (إيجابية الكاتلاز) باستخدام اختبار الكاتلاز.
2.كما أنها مفيدة في التفرقة بين البكتيريا الهوائية واللاهوائية.
3.يستخدم اختبار الكاتلاز الكمي للتعرف على السل المتفطرة.
4.يتم استخدامه للتمييز بين سلالات المطثية ، والتي تكون سلبية الكاتلاز ، من سلالات العصيات ، وهي سلالات موجبة.
5.يمكن استخدام اختبار كاتالاز كوسيلة مساعدة لتحديد البكتيريا المعوية.


إجراء اختبار كاتالاز ;-

طريقة الأنبوب :-

1.صب 1-2 مل من محلول بيروكسيد الهيدروجين في أنبوب اختبار.
2.باستخدام عصا خشبية معقمة أو قضيب زجاجي ، خذ عدة مستعمرات من 18 إلى 24 ساعة من كائن الاختبار واغمرها في محلول بيروكسيد الهيدروجين.
3.راقب للحصول على فقاعات فورية.

فيديو طريقة عمل الانبوب :-
https://youtu.be/prrA8dppHsU

طريقة الشريحة :-

1.استخدم حلقة أو عصا خشبية معقمة لنقل كمية صغيرة من نمو المستعمرة على سطح شريحة زجاجية نظيفة وجافة.
2.ضع قطرة من 3٪ H2O2 في الشريحة الزجاجية.
3.لاحظ تطور فقاعات الأكسجين.

فيديو طريقة عمل الشريحة :-
https://youtu.be/JtwXNO1zi3w

نتيجة تفسير اختبار كاتالاز وأمثلة


إيجابية: تنتج فقاعات غزيرة ، فقاعات نشطة :-
اسما بكتيريا مثل :-
Staphylococci, Micrococci, Listeria, Corynebacterium diphtheriae, Burkholderia cepacia, Nocardia, the family Enterobacteriaceae (Citrobacter, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Proteus, Salmonella, Serratia), Pseudomonas, Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus, Cryptococcus, and Rhodococcus equi.

سلبي: لا توجد فقاعات أو ينتج عنها عدد قليل جدًا من الفقاعات:-
اسماء بكثيريا مثل:-

Streptococcus and Enterococcus spp

احتياطات اختبار كاتالاز :-

1.لا ينبغي أن تؤخذ كائنات الاختبار من مزرعة أجار الدم. تحتوي خلايا الدم الحمراء على مادة الكاتلاز ووجودها يعطي نتيجة إيجابية زائفة.
2.يجب أن يكون عمر الثقافة من 18 إلى 24 ساعة.
3.يجب أن يكون بيروكسيد الهيدروجين طازجًا لأنه غير مستقر للغاية.
4.لا ينبغي استخدام حلقة الأسلاك الحديدية.
5.تنتج بعض البكتيريا البيروكسيداز الذي يحفز تكسير بيروكسيد الهيدروجين مما يتسبب في أن يكون التفاعل إيجابيًا بشكل ضعيف ؛ (بضع فقاعات تتطور ببطء). لا ينبغي الخلط بين هذا ورد الفعل الإيجابي حقًا.
6.لا تقم بإضافة كائن حي إلى الكاشف ، خاصة إذا تم استخدام حلقات التلقيح المحتوية على الحديد. سوف تتسبب الحلقات المحتوية على الحديد في نتائج اختبار إيجابية خاطئة إذا تعرضت لبيروكسيد الهيدروجين.


7.Coagulase Test :-

يستخدم اختبار تجلط الدم في التفريق بين المكورات العنقودية الذهبية (الموجبة) التي تنتج إنزيم تجلط الدم من S. epidermis and S. saprophyticus (سلبي) التي لا تنتج تجلط الدم.
المكورات العنقودية السلبية المخثرة (Coagulase Negative Staphylococcus اختصارهاCONS)

مبدأ اختبار تجلط الدم :-

تجلط الدم هو بروتين شبيه بالإنزيم ويسبب تجلط البلازما عن طريق تحويل الفيبرينوجين إلى الفيبرين. تنتج المكورات العنقودية الذهبية شكلين من أشكال تجلط الدم: مرتبط وحر.

إنزيم التخثر المرتبط (عامل التكتل) يرتبط بجدار الخلية البكتيرية ويتفاعل مباشرة مع الفيبرينوجين. ينتج عن هذا تناوب الفيبرينوجين بحيث يترسب على خلية المكورات العنقودية ، مما يتسبب في تكتل الخلايا عند خلط المعلق البكتيري بالبلازما. هذا لا يتطلب عامل تفاعل تجلط الدم.

تجلط الدم الحر ينطوي على تنشيط عامل تفاعل تجلط الدم بالبلازما (coagulase reacting factor -CRP) ، وهو جزيء ثرومبين معدل أو مشتق ، من تجلط الدم - مركب CRP. يتفاعل هذا المركب بدوره مع الفيبرينوجين لإنتاج جلطة الفيبرين.


إجراء وأنواع اختبار تجلط الدم :-

اختبار الشريحة (لاكتشاف إنزيم التخثر المرتبط) :-

1.ضع قطرة من محلول فسيولوجي في نهاية كل شريحة ، أو على شريحتين منفصلتين.
2.باستخدام الحلقة أو السلك المستقيم أو العصا الخشنة ، قم باستحلاب جزء من المستعمرة المعزولة في كل قطرة لعمل معلقتين سميكتين.
3.أضف قطرة من بلازما الإنسان أو الأرانب إلى أحد المعلقات ، واخلط بلطف.
4.ابحث عن تكتل الكائنات الحية في غضون 10 ثوانٍ.
5.لا يتم إضافة بلازما إلى التعليق الثاني للتمييز بين أي مظهر حبيبي للكائن الحي من تكتل تجلط الدم الحقيقي.

اختبار الأنبوب (للكشف عن تجلط الدم الحر) :-

1.خفف البلازما 1 في 10 في محلول ملحي فسيولوجي (اخلط 0.2 مل من البلازما مع 1.8 مل من محلول ملحي).
2.خذ 3 أنابيب اختبار صغيرة وقم بوضع ملصق عليها مثل T (اختبار) و P (تحكم إيجابي) و N (تحكم سلبي). الاختبار هو 18-24 ساعة لثقافة المرق ، والتحكم الإيجابي هو 18-24 ساعة ثقافة مرق المكورات العنقودية الذهبية والتحكم السلبي هو مرق معقم.
3.ماصة 0.5 مل من البلازما المخففة في كل أنبوب.
4.أضف 5 قطرات (0.1 مل) من كائنات الاختبار إلى الأنبوب المسمى "T" ، و 5 قطرات من استنبات S. aureus إلى الأنبوب المسمى "P" و 5 قطرات من المرق المعقم إلى الأنبوب المسمى "N".
5.بعد الخلط ، احتضان الأنابيب الثلاثة في 35-37 درجة مئوية.
6.افحص لتجلط الدم بعد 1 ساعة. إذا لم يحدث تخثر ، فقم بفحصه كل 30 دقيقة لمدة تصل إلى 6 ساعات.


فيديو طرقين شريحة و انبوب :-
https://youtu.be/Mtxs9iagW40

تفسير اختبار تجلط الدم

1 يشير التكتل في قطرتين الشريحتين إلى أن الكائن الحي يتراكم تلقائيًا وغير مناسب لاختبار تجلط الدم في الشريحة. يجب تأكيد جميع اختبارات الشريحة السلبية باستخدام اختبار الأنبوب.
2 أثناء اختبار الشريحة ، قد تكون هناك فرصة للحصول على نتائج إيجابية خاطئة في حالة استخدام السترات للبكتيريا (Enterococcus و Pseudomonas). في هذه الحالة أيضًا ، يجب إجراء اختبار الأنبوب وتأكيده.




Examples :-
Coagulase Positive Organisms:- Staphylococcus aureus and other animal host bacteria like S. pseudintermedius, S. intermedius, S. schleiferi, S. delphini, S. hyicus, S. lutrae, S. hyicus

Coagulase Negative Organisms:- Staphylococcus epidermidis, S. saprophyticus, S. warneri, S. hominis, S. caprae, etc.