التشخيص المختبري :-

1.Nutrient Agar :-

الآجار المغذي هو غرض عام ، وسيط مغذي يستخدم لزراعة الميكروبات التي تدعم نمو مجموعة واسعة من الكائنات غير الحساسة. يشتهر أجار المغذيات لأنه يمكن أن ينمو مجموعة متنوعة من البكتيريا والفطريات ، ويحتوي على العديد من العناصر الغذائية اللازمة لنمو البكتيريا.

تكوين أجار المغذيات :-

- 0.5٪ ببتون
إنه هضم إنزيمي للبروتين الحيواني. الببتون هو المصدر الرئيسي للنيتروجين العضوي للبكتيريا النامية.

- 0.3٪ مستخلص لحم البقر / مستخلص الخميرة
هي المواد القابلة للذوبان في الماء التي تساعد في نمو البكتيريا ، مثل الفيتامينات والكربوهيدرات ومركبات النيتروجين العضوية والأملاح.

- 1.5٪ أجار
إنه عامل التصلب.

- 0.5٪ كلوريد الصوديوم
يحافظ وجود كلوريد الصوديوم في أجار المغذيات على تركيز الملح في الوسط الذي يشبه السيتوبلازم في الكائنات الحية الدقيقة.

- ماء مقطرة
الماء ضروري لنمو وتكاثر الكائنات الحية الدقيقة ، كما أنه يوفر الوسيلة التي يمكن من خلالها نقل العناصر الغذائية المختلفة.

- يتم ضبط Ph الأس الهيدروجيني إلى متعادل (7.4) عند 25 درجة مئوية.

تحضير أجار المغذيات :-

1.علق 28 جم من مسحوق أجار المغذي في 1 لتر من الماء المقطر.
2.سخني هذا الخليط مع التحريك لإذابة جميع المكونات بالكامل.
3.الأوتوكلاف المخلوط المذاب عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4.بمجرد تعقيم أجار المغذيات ، اتركه ليبرد ولكن لا يتصلب.
5.نصب أجار المغذيات في كل لوحة وترك الصفائح على السطح المعقم حتى يصلب أجار.
6.أعد وضع غطاء كل طبق بتري وقم بتخزين الأطباق في الثلاجة.

استخدامات أجار المغذيات:-

1. كثيرا ما يستخدم لعزل وتنقية الزراعة.

2. يمكن استخدامه أيضًا كوسيلة لإنتاج المروج البكتيرية اللازمة لاختبارات الحساسية للمضادات الحيوية. في الواقع ، عادةً ما يتم إجراء اختبار حساسية المضادات الحيوية على وسائط مصممة خصيصًا لهذا الغرض.


فيديو عمل Nutrient Agar :-
https://youtu.be/YX_b02KYN9g

2.تلطيخ الجرام(Gram staining):-

يعد تلطيخ الجرام أحد أساليب التلوين التفاضلي الشائعة والأكثر استخدامًا في علم الأحياء الدقيقة ، والذي قدمه عالم البكتيريا الدنماركي هانز كريستيان جرام في عام 1884. هذا الاختبار يميز البكتيريا إلى بكتيريا موجبة الجرام وبكتيريا سلبية الجرام ، مما يساعد في تصنيف وتمايز البكتريا. الكائنات الدقيقة.


مبدأ تلوين غرام:-

عندما تكون البكتيريا ملطخة بالبقعة الأولية Crystal Violet ويتم إصلاحها بواسطة الرائحة ، فإن بعض البكتيريا قادرة على الاحتفاظ بالبقعة الأولية وبعضها يتم إزالة اللون بواسطة الكحول. تحتوي جدران خلايا البكتيريا الموجبة للجرام على طبقة سميكة من مجمعات البروتين والسكر تسمى ببتيدوغليكان ومحتوى الدهون منخفض. يؤدي إزالة لون الخلية إلى تجفيف جدار الخلية السميك وتقليصه ، مما يؤدي إلى إغلاق المسام في جدار الخلية ومنع البقعة من الخروج من الخلية. لذلك لا يمكن للإيثانول إزالة مركب Crystal Violet-Iodine المرتبط بالطبقة السميكة من الببتيدوغليكان للبكتيريا الموجبة للجرام ويظهر باللون الأزرق أو الأرجواني.

في حالة البكتيريا سالبة الجرام ، يأخذ جدار الخلية أيضًا مركب CV-Iodine ولكن نظرًا للطبقة الرقيقة من الببتيدوغليكان والطبقة الخارجية السميكة التي تتكون من الدهون ، يتم غسل مركب CV-Iodine. عندما يتعرضون للكحول ، يقوم مزيل اللون بإذابة الدهون في جدران الخلايا ، مما يسمح لمركب اليود البنفسجي البلوري بالتسرب من الخلايا. ثم بعد تلطيخها مرة أخرى بالسفرانين ، تأخذ البقعة وتظهر باللون الأحمر.

الكواشف المستخدمة في تلطيخ الجرام :-

1.Crystal Violet, the primary stain
2.Iodine, the mordant
3.(A decolorizer made of acetone and alcohol (95%
4.Safranin, the counterstain

إجراء تلوين غرام :-

1.خذ شريحة نظيفة وخالية من الشحوم.

2.تحضير مسحة التعليق على الشريحة النظيفة بحلقة من العينة(يقصد فيها بكتيريا).

3.يكون الهواء الجاف والحرارة.

3.تم سكب Crystal Violet وحفظه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة وشطفه بالماء.

4.اغمر يود(Iodine) الجرام لمدة دقيقة واغسله بالماء.

5.بعد ذلك ،اغسليها باستخدام 95٪ كحول أو أسيتون لمدة 10-20 ثانية ثم اشطفيها بالماء.

6.يضف safranin لمدة دقيقة واحدة واغسله بالماء.

7.يجفف في الهواء و نشوفه تحت المجهر.

تفسير :-

غرام إيجابي: اللون الأزرق / الأرجواني.

سلبية الغرام: اللون الأحمر.



طريقة عمل Gram Staining :-
https://youtu.be/sxa46xKfIOY

:-Examples
Gram Positive Bacteria:- Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces ,etc.
Gram Negative Bacteria:- Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Shigella, and other Enterobacteriaceae, Pseudomonas,Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, acetic acid bacteria, Legionella etc

3.blood agar اجار دم :-

أجار الدم (BA) عبارة عن وسط مخصب يستخدم لزراعة البكتيريا أو الميكروبات التي لا تنمو بسهولة. تسمى هذه البكتيريا "حساسة" لأنها تتطلب بيئة غذائية خاصة ومخصبة مقارنة بالبكتيريا الروتينية. يستخدم آجار الدم في زراعة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض خاصة تلك التي يصعب نموها مثل Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae and Neisseria species.

كما أنه مطلوب للكشف عن البكتيريا الحالة للدم والتمييز بينها ، وخاصة أنواع Streptococcus. وهو أيضًا وسيط تفاضلي يسمح باكتشاف انحلال الدم (تدمير كرات الدم الحمراء) عن طريق السموم الحالة للخلايا التي تفرزها بعض البكتيريا ، مثل سلالات معينة من Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, and Aerococcus.

يمكن جعل أجار الدم انتقائيًا لبعض مسببات الأمراض عن طريق إضافة المضادات الحيوية أو المواد الكيميائية أو الأصباغ. تشمل الأمثلة أجار الدم البنفسجي الكريستالي لاختيار Streptococcus pyogens من مسحات الحلق ، وأجار الدم kanamycin أو neomycin لاختيار اللاهوائية من القيح(pus).


ما هو تكوين آجار الدم :-

- 0.5٪ ببتون

-0.3٪ مستخلص لحم البقر / مستخلص الخميرة

-1.5٪ أجار

-0.5٪ كلوريد الصوديوم

-ماء مقطرة

(بما أن Blood Agar مصنوع من Nutrient Agar ، أعلاه هو تكوين Nutrient Agar)

-5٪ دم غنم

-ph يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني من 7.2 إلى 7.6 (7.4)


تحضير آجار الدم

1.نقوم بخد 28جم من مسحوق أجار المغذي في 1 لتر من الماء المقطر.

2.سخن هذا الخليط مع التقليب لإذابة جميع المكونات تمامًا.

3.الأوتوكلاف الخليط المذاب على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

4.بمجرد تعقيم أجار المغذيات ، اتركه ليبرد ولكن لا يتصلب.

5.عندما يبرد الأجار إلى 45-50 درجة مئوية ، أضف 5٪ (حجم / حجم) دم معقم منزوع الليف تم تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة واخلطه برفق ولكن جيدًا.

6.تجنب فقاعات الهواء.

7.الاستغناء عن السائل في أطباق معقمة.


استخدامات أجار الدم

1.أجار الدم هو وسيلة مخصبة للأغراض العامة تستخدم غالبًا في زراعة الكائنات الحية الدقيقة.

2.لتمييز البكتيريا بناءً على خصائصها الانحلالية (انحلال الدم β ، انحلال الدم α (أو غير الانحلالي)).

شكل بكتيريا في اجار دم و بكتيريا S.aureus انحلال الدم β

فيديو عمل طريقة blood agar :-
https://youtu.be/bsIoTuzAjpw

4.تخمير المانيتول Mannitol fermentation :-

يستخدم مانيتول ملح أجار (MSA) كوسيط انتقائي وتفاضلي لعزل وتحديد المكورات العنقودية الذهبية من العينات السريرية وغير السريرية. يشجع على نمو مجموعة من البكتيريا بينما يمنع نمو أنواع أخرى. وهو عبارة عن وسط انتقائي تم إعداده وفقًا لتوصيات تشابمان لعزل المكورات العنقودية المسببة للأمراض.

تكوين مانيتول ملح أجار (MSA) :-

المكونات و جم / لتر :- المجموع 111.025 جرام

1.خلاصة البنكرياس للكازين 5.0 جم
2.الهضم الهضمي للانسجة الحيوانية 5.0 جم
3.خلاصة اللحم البقري 1.0 جم
4.كلوريد الصوديوم 75.0 جم
5.د- مانيتول 10.0 جم
6.فينول أحمر 0.025 جم
7.أجار 15.0 جرام
-ماء مقطر = 1000 مل
-الرقم الهيدروجيني النهائي 7.4 ± 0.2 عند 25 درجة مئوية.

مبدأ مانيتول ملح أجار :-

يحتوي ملح مانيتول أجار على بيبتون وخلاصة لحوم البقر التي تزود النيتروجين والفيتامينات والمعادن والأحماض الأمينية الضرورية للنمو. ينتج عن تركيز 7.5٪ من كلوريد الصوديوم تثبيط جزئي أو كامل للكائنات البكتيرية غير المكورات العنقودية.


يوفر كلوريد الصوديوم أيضًا الإلكتروليتات الأساسية للنقل والتوازن التناضحي. المانيتول هو الكربوهيدرات القابلة للتخمر ، التي يؤدي تخميرها إلى إنتاج حمض ، يتم اكتشافه بواسطة مؤشر أحمر الفينول ، ويساعد في التمايز بين أنواع المكورات العنقودية.

تنتج المكورات العنقودية الإيجابية المخثرة (على سبيل المثال ، Staphylococcus aureus) مستعمرات صفراء ووسط أصفر محيط بينما تنتج المكورات العنقودية السلبية المخثرة مستعمرات حمراء ولا يتغير لون مؤشر الفينول الأحمر. أجار هو عامل التصلب.


تسمح إضافة مستحلب صفار البيض بنسبة 5٪ حجم / حجم باكتشاف نشاط الليباز للمكورات العنقودية جنبًا إلى جنب مع تخمر المانيتول. يزيل الملح مستحلب صفار البيض ويتم الكشف عن إنتاج الليباز كمنطقة صفراء معتمة حول المستعمرات.

استخدامات مانيتول ملح أجار :-

1.يتم استخدامه للعزل الانتقائي والتمايز للمكورات العنقودية الذهبية من العينات السريرية.
2.كما أنها تستخدم لتعداد المكورات العنقودية في الأغذية ومنتجات الألبان.
3.تم تضمين هذه الوسيلة أيضًا في الدليل التحليلي البكتريولوجي لاختبار مستحضرات التجميل.
4.كما يستخدم في الفحص البكتريولوجي لمياه حمامات السباحة والمنتجعات الصحية ومياه الشرب باستخدام الترشيح الغشائي.

تحضير مانيتول ملح أجار :-

1.قم بتعليق 111.025 جم من وسط MRS في 1000 مل من الماء المقطر.
2.غلي المزيج لإذابة الوسائط تمامًا.
3.الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
(اختياري: أضف 5٪ حجم / حجم مستحلب صفار البيض)
4.يبرد حتى 45-50 درجة مئوية ويصب في أطباق بتري.


تفسير النتيجة على مانيتول ملح أجار :-


نتائج الكائنات الحية :-

1.Staphylococcus aureus:-مستعمرات صفراء ذات مناطق صفراء.
2.(Staphylococci other than S. aureus (e.g. Staphylococcus epidermidis :-مستعمرات عديمة اللون أو حمراء مع مناطق حمراء.
3.Streptococci:-لا يوجد نمو لتتبع النمو.
4.Micrococci:-كبيرة بيضاء إلى برتقالية.
5.Gram-negative bacteria:-لا يوجد نمو لتتبع النمو.


حدود مانيتول ملح أجار :-

1.العديد من أنواع المكورات العنقودية غير الذهبية موجبة للمانيتول وتنتج مستعمرات صفراء محاطة بمناطق صفراء على هذا الوسط (على سبيل المثال S. capitis ، S. xylosus ، S. cohnii ، S. sciuri ، S. simulans ، وأنواع أخرى). لذلك ، من الضروري إجراء المزيد من الاختبارات البيوكيميائية لتحديد بكتريا المكورة العنقودية الذهبية أو الأنواع الأخرى.
2.يتم تثبيط معظم الكائنات الحية بخلاف المكورات العنقودية بسبب تركيز الملح العالي الموجود في مانيتول سولت أجار باستثناء بعض الكائنات البحرية الملحية.
3.قد تظهر سلالات قليلة من المكورات العنقودية الذهبية تخمر متأخر من مانيتول. يجب إعادة تحضين الصفائح السلبية طوال الليل قبل التخلص منها.
4.يجب تأكيد المكورات العنقودية الذهبية الافتراضية باختبار تجلط الدم.

فيديو عمل Mannitol Salt Agar :-

https://youtu.be/s6Wg8GcwoLk


5.اختبار قرص فيرازوليدون Furazolidone Disk Test :-


يتم إجراء اختبار قرص فيورازوليدون (فوروكسون) كإجراء لحساسية القرص باستخدام أقراص فيورازوليدون المتاحة تجارياً. يتم تثبيط المكورات العنقودية بواسطة فيورازوليدون ولكن المكورات الدقيقة والأنواع ذات الصلة مقاومة. هذه هي إحدى الطرق الشائعة الاستخدام للتمييز بين المكورات العنقودية والمكورات الدقيقة. تنمو المكورات الدقيقة عادة حتى حافة قرص فيورازوليدون 6 مم.

فوروكسون (فيورازوليدون) هو أحد مضادات الميكروبات النيتروفوران الاصطناعية مع نشاط مضاد للأوالي والبكتيريا. فيرازوليدون يربط الحمض النووي البكتيري مما يؤدي إلى تثبيط تدريجي لأكسيداز أحادي الأمين.

ومع ذلك ، يمكن رؤية المكورات العنقودية السلبية المخثرة المقاومة للفيورازوليدون في بعض الأحيان.

الكواشف
1 أقراص Furazolidone ، 100 ميكروغرام.
2 صفيحة أجار مولر-هينتون.

إجراء
1 قم بإعداد معلق للكائن الحي ليتم اختباره في الماء المقطر المعقم . يجب أن يكون التعليق معادلاً لمعيار التعكر 0.5 McFarland.
2 باستخدام مسحة ، انشر معلق الكائن الحي على نصف صفيحة أجار مولر-هينتون.
3 ضع قرص فيورازوليدون بطريقة معقمة في وسط المنطقة الملقحة ، واضغط برفق على القرص بحيث يلتصق بسطح أجار.
4 احتضان الطبق عند 35 درجة مئوية في حاضنة الهواء المحيط لمدة 18-24 ساعة.



النتائج والتفسيرات :-

1 مقاومة فيرازوليدون: منطقة التثبيط 9 مم. E.g. Micrococcus luteus

2 فيورازوليدون حساس: منطقة التثبيط> 15 مم. E.g. Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus

فيديو Furazolidone Disk Test :-
https://youtu.be/sx1uDYSfINA